您现在的位置:首页 > >

新生大鼠心肌细胞原代培养分离方法的改进


?54 ?

白表达 ,抑制了心律失常和细胞凋亡 ,且与缬沙坦抗缺血/ 再灌 注损伤效果相近 。 参考文献 :
apopto sis and improves cardiac f unction in res ponse to myocardial

摘要 : 目的   探索并改进乳鼠的心肌细胞原代培养方法 。方法   以混合消化酶 ( 0. 08 %胰蛋白酶加 0. 04 %~ 0. 06 % Ⅱ 型胶原 酶等量加入的混合液) 消化心肌组织 ,差速贴壁分离纯化后 ,加入 52溴脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞分裂增殖 。结果   本方法培养的 心肌细胞 12 h 后即出现单个细胞搏动 ,2 d~5 d 可见明显搏动的心肌细胞和心肌细胞团 , 成纤维细胞无明显增殖 。结论   本方法 是一种较为理想的乳鼠心肌细胞原代培养方法 。 关键词 : 心肌细胞 ; 原代培养 ; 乳鼠 中图分类号 : R329. 2     文献标识码 :A     文章编号 :167221349 ( 2009) 0120054202    心肌细胞原代培养技术已广泛应用于心血管疾病机制及心 血管药物的研究 。1960 年 Hararacy 等 [1 ] 首次对乳鼠的心肌细 胞进行培养以来 ,国内外许多学者对心肌细胞原代培养方法进 行了研究 [224 ] 。体外培养的心肌细胞能够保持其在体内原有的 许多结构和功能 ,同时排除了神经 、 体液等因素的干扰 ,因此在 心肌细胞的生长发育 、 生理 、 代谢 、 病理等研究中具有重要意义 。 1  材料与方法 1. 1   实验动物  Wistar 乳鼠 ,1 d ~ 3 d 龄 , 雌雄不限 , 由甘肃 中医学院科研实验动物中心提供 。 1. 2   主要试剂及实验设备   EM 培养基 ( 高糖 ) ( Gibco , 美 DM 国) 、 HamF12 培养基 ( Gibco ,美国 ) 、2溴脱氧尿嘧啶 ( Sigma ,美 5 国) ; 胰蛋白酶 ( Amresco , 美国 ) 、 Ⅱ型胶原酶 ( Sigma , 美国 ) ; 新 生牛血清 (NBCS ,杭州四季青 ) 购自上海生物工程技术有限公 α α 司。 2横 纹 肌 肌 动 蛋 白 单 克 隆 抗 体 ( 2sarcomeri2cactin ,α SA) , 2 链 霉 素 亲 和 素 2生 物 素 2 过 氧 化 物 酶 复 合 物 ( st rept avidin biotin peroxydase complex ,SABC) 免疫组化试剂盒购自武汉博 士德生物工程有限公司 。其他试剂均为分析纯 。二氧化碳培养
   为十一五国家科技支撑计划子课题基金项目 ( No . 2006BA I06A20204) 1)

[ 1 ]  Peitan L ,Baohuan X , Thomas A ,et al . Pifithrin2aattenuates p532mediated [2]   Silvia N ,Lorenzo C ,Avio MP , et al . Relaxin induces mast cell inhi bition and reduces vent ricular arrhyt hmias in a swine model of [ 3 ]  Gudkov A , Komarova EA. Pro spective t herapeutic applications of 736. [4]   Schuler M ,Maurer U , Goldstein J C , et al . P53 t riggers apopto sis in [5]   徐光 ,张礼萍 ,沈慧芬 ,等 . 野黄芩苷元及其类似物对蛋白激酶 C 的 ischemia/ reperf usion in aged rat s[J ] . Shock ,2006 ,26 (6) :6082614. 57 :43248. 460. acute myocardial infarction [ J ] . Pharmacological Research , 2008 ,

oncogene2exp ressing fibrob last s by t he induction of noxa and mi2

tochondrial bax t ranslocation [ J ] . Cell Deat h Differ , 2003 , 4 : 4512

p53 inhibitors[J ] . Biochem Biop hys Res Co mmun ,2005 ,331 : 7262

新生大鼠心肌细胞原代培养分离方法的改进
关   ,李应东 ,马海彦 ,刘   欣 凯

C HIN ESE J OU RNAL O F IN TEGRA TIV E M EDICIN E ON CARDIO2/ CER EBROVASCUL A R DISEASE   anuary   J 2009   Vo1. 7   . 1 No

) 作者简介 : 王利果 (1981 — ,女 ,毕业于辽宁医学院 ,硕士研究生 , 现工作

于辽宁医学院附属第一医院 ( 邮编 :121001) ; 李树青 ,工作于辽宁医学院 附属第一医院 。
( 收稿日期 :2008208201) ( 本文编辑 王雅洁) 1)

箱 ( 德国 Heraeus 公司) ; 超净工作台 ( 苏净集团) ; 倒置相差光学 显微镜 ( 日本 Olymp us 公司) 。 1. 3   试剂配制  胰蛋白酶 ( 无 菌分 装 ) 溶于 PBS 缓 冲液 ( p H 7. 2 ~ 7. 4) 中 , 配成 0. 08 %的胰蛋白酶消化液 ; 将 Ⅱ型胶原酶 ( 无菌分装) 溶于已配制好的胰蛋白酶消化液中 ,配成 0. 04 %~ 0. 06 %的混合酶消化液 。DM EM 培养基与 HamF12 培养基按 1 ∶ 比例混合后 ,碳酸氢钠调节 p H 为 7. 2~7. 4 。 1 1. 4   细胞分离培养  乳鼠心肌细胞的原代培养及纯化根据 Simp so n [5 ] 的方法 。取 1 d ~3 d 龄 Wistar 大鼠 ,用 75 %的乙醇 棉球将其全身擦洗消毒 ,然后乙醚麻醉 ,75 %乙醇再消毒 。无菌 开胸 ,暴露心脏 ,于心脏收缩期剪下心脏 ,置于预冷的盛 PBS 缓 冲液的培养皿中 ,清洗 3 次 ,以去除血细胞 ,取心尖部组织剪为 1 mm3 碎块 ,加入 0. 08 %胰蛋白酶溶液消化 10 min , 前两次消 化沉淀后弃上清 ,去除血细胞 。剩余组织块中加入混合消化酶 ( 0. 08 %胰蛋白酶加 0. 04 %~0. 06 % Ⅱ 型胶原酶等量加入的混 合液) 置 37 ℃ 水浴消化 8 min ,静置后将上清液移入盛有 15 % 新生牛血清的 DF 培养液的离心管中终止消化 ,并以 1 000 r/ min

[ 6 ]   alowy A , Schulz R , Heusch G. A T1 receptor blockade in experi2 J mental myocardial ischemia/ reperfusion [J ] . J Am Society Nephrolo , [ 7 ]  Levi R , Smit h NCE. Hista mine H32receptors : A new f rontier in 830. [ 9 ]  Xue H , HC Shinya M , Kenichiro K , et al . In vivo hepat ocyte injury t hrough it s multiple actions[J ] . J Cardiac Failure ,2007 ,13 (10) :8742883. totic response[J ] . Cell Deat h Differ ,2003 ,4 :4092412. [ 8 ]  Weber J D , Zambetti GP. Renewing t he debate over t he p53 apop2 growt h factor gene transfer reduces myocardial ischemia2reperfusion 1999 ,10 (11) :1292136.

抑制作用 [J ] . 上海医科大学学报 ,1993 ,20 (3) :1872191.

myocardial ischemia [ J ] . J Pharmacol Exp Ther , 2000 , 292 : 8252

? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

http://www.cnki.net

中西医结合心脑血管病杂志 2009 年 1 月第 7 卷第 1 期 离心 10 min ,弃上清液 ,用 DF 培养液充分吹打成单细胞悬液 。 剩余沉淀用同样条件及方法反复消化 , 直至将组织基本完全消 化变为半透明状为止 。收集各次消化所得细胞悬液接种于 6 孔 培养板中 。采取差速贴法壁和化学方法分离纯化心肌细胞 。37 ℃,5 % CO 2 培养箱中孵育 1 h ,分离纯化心肌细胞 。非心肌细 胞贴壁速度较快 ,首先附在瓶底 ,心肌细胞仍处于悬浮状态 。吸 出细胞悬液离心 ,将沉淀混悬按 0. 8 ×10 5 / m2 ~ 1 ×10 5 / m2 的 密度接种于 6 孔培养板 ,每孔置 1 cm ×1 cm 的盖玻片 ( 预先用 鼠尾 胶 原 处 理 ) , 以 便 作 免 疫 组 化 进 行 纯 度 鉴 定 。 0 . 1 用 mmol/ L 52Brdu 的培养基培养 3 d , 以抑制非心肌细胞增殖 , 然 后换为常规培养基培养 ,每 2 d ~3 d 换液 1 次 。 1. 5   细胞形态学观察   倒置相差显微镜观察细胞 ,并照相 。 1. 6   存活率检测   差速贴壁后取细胞悬液 ,用适量 0. 4 %台盼 蓝稀释 ,混匀后滴于血细胞计数板上 ,倒置相差光学显微镜下观 察细胞形态并计总数 ,着色者为死细胞 ,不着色者为活细胞 。计 算细胞存活率 。 1. 7   细胞纯度鉴定   培养 1 d 、 d 、 d 、 d 取出培养板中盖玻 2 4 8 片 , PBS 清洗后固定 ,用α SA 免疫组化标记心肌肌动蛋白 。心 2 肌细胞α SA 抗原表达阳性 , 呈棕黄色 , 位于胞浆 ; 非心肌细胞 2 中阴性 ,心肌细胞α SA 阳性率反映心肌细胞数量 , 可作为心肌 2 细胞纯度鉴定的指标 。镜下任选 10 个视野 ,计数 200 个细胞视 野 ,计算阳性细胞的比率 。 2    结 果 2. 1   细胞形态观察   倒置相差光学显微镜下观察并拍照 ,刚分 离的心肌细胞呈球形 ,培养 8 h 细胞开始贴壁生长 ,呈圆形或椭 圆形 , 后变为梭形 , 细胞在瓶壁逐渐展开 、 伸出伪足 , 变为三角 形、 多边形等形态 ,核仁清晰 ; 培养 12 h 细胞基本贴壁 ,少数贴 壁的单个细胞出现自发性搏动 ,搏动的频率 、 节律不同 ; 培养 24 h 后可完全贴壁 ; 培养 3 d ~4 d 后可形成单层 ,第 3 天细胞伸出 的伪足相互接触交织成网 ,逐渐形成细胞簇或细胞单层 ,呈放射 状排列的同心圆状 ,搏动呈同步性 ,收缩明显而有力 , 形成所谓 功能性合体细胞 , 搏动频率多在 40/ min ~ 120/ min 。培养的心 肌细胞第 16 天时心肌细胞活力开始下降 ,搏动次数减少 ,搏动 幅度明显降低 ,心肌细胞形态开始明显改变 ,细胞部分开始皱缩 脱落 ,培养第 18 天时部分细胞停止搏动 ,形态发生很大变化 ,心 肌细胞的胞浆出现空泡和粗大颗粒样物质 ,细胞大多皱缩脱落 。 从形态上不易区分心肌细胞和成纤维细胞 ,然成纤维细胞 不搏动 ,平坦 ,胞质透明 ,显得很薄 ,细胞核小 , 椭圆形 , 颜色淡 , 经常含有 2 个~3 个核 。 2. 2   存活率   共计数 862 个细胞 ,其中 36 个细胞着色阳性 ,细 胞存活率为 95. 8 % 。心肌细胞培养 24 h 后 ,观察液面无悬浮的 死细胞 。 α 2. 3   纯度鉴定   2SA 标记心肌肌动蛋白 。镜下任选 10 个视 野 ,计数 200 个细胞视野 ,计算阳性细胞的比率 ( 表 1) 。
培养时间 (d)
1 2 4 8

?55 ?
3    讨 论

作者简介 : 关欣 ,现工作于甘肃中医学院 ( 邮编 : 730000) ; 李应东 、 马海 彦、 刘凯 ,工作于甘肃中医学院 。
( 收稿日期 :2008208229) ( 本文编辑 王雅洁)

阳性细胞数
1 796 1 737 1 498 1 277

? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

表1  心肌细胞α SA 阳性率 2 细胞总数
2 000 2 000 2 000 2 000

阳性率 ( %)
89. 8 86. 9 74. 9 63. 9

心肌细胞原代培养技术虽已广泛用于心血管疾病的研究 , 然而其活细胞几乎不分裂 ,不易传代 ,且分离过程中易受到损伤 致使原代培养细胞产量较低 ,实验效率不高 ,影响实验模型的建 立 。因此 ,心肌细胞培养成功的关键在于减轻分离过程中的机 械和化学损伤 ,尤其要减轻消化酶对其处理而造成损伤 。消化 过度或酶使用不当均能导致心肌细胞丧失贴壁和/ 或自发节律 性搏动的能力 。心肌细胞培养的另一个普遍问题是心肌细胞纯 度和收获率的问题 。许多文献报道差速贴壁的时间为 1. 5 h~ 2. 0 h ,然而在多次实验中发现差速贴壁 1 h 左右即有部分心肌 细胞贴壁 ,且均为活力较好的心肌细胞 。因此 ,差速贴壁的时间 长虽然可以尽量纯化心肌细胞 , 但差速贴壁后留在细胞悬液中 的心肌细胞数量较少且活力较差 。衡量利弊并总结经验 ,我们 将差速贴壁的时间定在 1 h ,发现心肌细胞获取率明显增加 ,且 培养第 8 天 ,心肌细胞纯度仍可以达 60 %以上 。在整个操作过 程中需注意以下几点 : ① 消化选用作用较温和的 Ⅱ 型胶原酶加 入到消化作用较强的胰蛋白酶中以缓冲胰蛋白酶对心肌细胞的 损伤 , Ⅱ 型胶原酶的浓度选择在 0. 04 %~ 0. 06 %为宜 , 既可较 快地消化组织块 ,又不会对心肌细胞造成损伤 。 ② 消化时水浴 温度为 8 min ,37 ℃ 为宜 , 消化时间过长 、 温度过高均会使心肌 细胞丧失活性 。 ③ 分离细胞整个过程中动作需轻柔 , 离心时间 过长或离 心 力 过 大 均 会 造 成 心 肌 细 胞 的 机 械 性 损 伤 , 选 用 1000r/ min离心 10 min 为宜 。 1 h 差速贴壁分离法纯化后 , 加入 ④ 52溴脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞的 DNA 和蛋白合成 ,通过抑制 成纤维细胞的分裂增殖 ,保证培养 3 d~ 5 d 后心肌细胞仍可保 持较高纯度 。 本研究介绍的心肌细胞原代培养方法 , 细胞贴壁快 , 搏动 早 ,且纯度高较 ,操作简便 ,重复性好 ,是一种较为理想的心肌细 胞原代培养方法 。 参考文献 :
[ 1 ]  Harary L , Farly B. In vit ro st udies of single isolated beating heart cells[J ] . Science ,1960 ,131 (2) :167421675. adrenergic receptor up regulation induced by ACE inhibition in (22) :226822273. cult ured neonatal rat cardiac myocytes [ J ] . Circulation , 1998 , 97 [ 3 ]  Tanaka M ,Ito H ,Adachi S , et al . Hypoxia induced apopto sis wit h neonatal rat cardio myocytes[J ] . Circ Res ,1994 ,75 (3) :4262433. Circ Res ,1982 ,50 (1) :1012116. enhanced exp ression of fas antigen messenger RNA in cult ured [4]   董丰 ,龚开政 ,张振刚 ,等 . 原代心肌细胞培养方法的探讨 [J ] . 大连 [ 5 ]  Simp son P , Savion S. Differentiation of rat myocytes in single cell cult ures wit h and wit hout p roliferating nonmyocardial cells [ J ] .

[ 2 ]   Yonemochi H , Yasunaga S , Teshima Y , et al . Mechanism ofβ

医科大学学报 ,2001 ,23 (4) :3072308.

http://www.cnki.net



热文推荐
友情链接: 医学资料大全 农林牧渔 幼儿教育心得 小学教育 中学 高中 职业教育 成人教育 大学资料 求职职场 职场文档 总结汇报